Rýchly rozvoj sekvenčných metód začiatkom milénia umožnil prečítanie kompletných genómov modelových organizmov, na ktorých prebieha väčšina biologického výskumu. Vedcov však zaujímajú i genetická rôznorodosť a evolučné vzťahy medzi menej študovanými organizmami. Nevšedné riešenia, ktoré môžu odhaliť, by mohli nájsť aj praktické využitie vo výskume či medicíne.
V rokoch 1992 až 2009 prebiehal v montrealskom laboratóriu profesorov Gertraud Burgerovej a Franza Langa rozsiahly projekt sekvenovania mt a chloroplastových genómov dovtedy zanedbávaných prvokov (The Organelle Genome Megasequencing Program). Výberovým kritériom bola aj možnosť kultivovať ich v laboratóriu a získať tak dostatočné množstvo buniek na izoláciu DNA. Z publikácií o desiatkach týchto genómov však roky vynechávali bičíkovca Diplonema papillatum, pretože sekvencia jeho mtDNA nedávala zmysel. Tento morský jednobunkovec ich o to viac zaujal a začali ho podrobne skúmať, hoci v tom čase bol takmer neznámy. Až v roku 2015 vyšiel článok s analýzou výsledkov dvoch medzinárodných oceánografických expedícií (2009 až 2013) geneticky mapujúcich diverzitu planktónu a ukazujúci, že diplonemidy žijú vo všetkých skúmaných moriach a ich výskyt stúpa s hĺbkou. V približne 800 miliónoch analyzovaných sekvencií DNA predstavovali šiestu najpočetnejšiu skupinu eukaryotov obsahujúcu približne 12 300 druhov (na porovnanie: poznáme viac ako 20 000 druhov včiel). Ešte väčším prekvapením bičíkovca Diplonema papillatum však bola pre vedcov sekvencia a organizácia jej mtDNA.
Matúš Valach po maturite na francúzskom bilingválnom Gymnáziu Metodova v Bratislave študoval na Prírodovedeckej fakulte Univerzity Komenského chémiu na bakalárskom a biochémiu na magisterskom stupni. Od prvého ročníka pracoval v Laboratóriu funkčnej a komparatívnej genomiky eukaryotických organel Katedry biochémie pod vedením prof. Jozefa Noseka. Po obhajobe dizertačnej práce o diverzite mitochondriálnych (mt) genómov kvasiniek rodu Candida začal koncom roku 2011 postdoktorandský pobyt v Centre bioinformatiky a genomiky Roberta Cedergrena na Katedre biochémie Montrealskej univerzity. Tam pôsobí od roku 2017 ako vedecký pracovník, naďalej pod vedením prof. Gertraud Burgerovej. Hoci s profesorkou komunikuje hlavne po anglicky, ovládanie francúzštiny sa mu hodí nielen v bežnom živote vo frankofónnej provincii, ale aj v komunikácii so študentmi a pracovníkmi fakulty.
Rozkúskovaný genóm
Pri čítaní DNA vedci porovnávajú získané sekvencie s tými v databáze, aby identifikovali jednotlivé gény, pretože obvykle sú si aspoň do istej miery podobné. V mtDNA tohto bičíkovca však najskôr žiadne nenašli. No keďže už bol známy nevšedný mt genóm parazitickej trypanozómy (spôsobujúcej spavú chorobu a príbuznej bičíkovca D. papillatum), prof. Burgerová sa ním inšpirovala a na dáta sa pozrela inak. Uvedomila si, že aj mt genóm D. papillatum je rozkúskovaný na kratučké kružnicové časti a gény sa sekvenciami len málo podobajú na tie z príbuzných organizmov, lebo v nich mnohé písmená chýbajú a ďalšie sú, naopak, veľmi odlišné od toho, čo by sa bežne očakávalo. Na rozdiel od trypanozómy však každý krúžok obsahuje hlavne nekódujúce sekvencie obklopujúce iba malý úsek génu. Kúsky mediátorových RNA (mRNA), ktoré vznikajú prepisom týchto úsekov, teda musia byť v bunke správne pospájané, aby každá vo finále obsahovala informáciu pre celý jeden proteín. Okrem toho musia byť aj správne pozmenené (editované), aby ich text zodpovedal proteínu, ktorý má vzniknúť ich preložením. Vedci teda sekvenovali aj tieto editované mRNA. Ich sekvencie sa už oveľa viac podobali svojim príbuzným v databázach.
Editovanie mRNA síce bolo známe z rôznych organizmov vrátane ľudskej jadrovej DNA, obvykle však spočíva v chemickej zmene, pridaní či odstránení len jedného či niekoľkých písmen (báz). Aj spájanie kúskov RNA (kódujúcich častí génu) do finálnej mRNA (tzv. zostrih či splicing) už bolo popísané; najčastejšie prebieha len odstránením niekoľkých častí transkriptu, iba veľmi zriedkavo aj spájaním kódujúcich častí z odlišných RNA.
Rozlúštenie šifrovaných génov
Výnimočný mt genóm D. papillatum zaujal počas doktorandského štúdia aj Matúša Valacha. So spomenutými montrealskými vedcami sa stretol na konferenciách a podarilo sa mu získať miesto postdoktoranda u prof. Burgerovej. Okrem vylepšenia spôsobu kultivácie D. papillatum priniesol Matúš krátko po príchode v roku 2011 aj objasnenie záhady génu NAD4 a našiel viacero ďalších dovtedy nerozpoznaných génov v sekvenčných dátach mtDNA D. papillatum.
Gén NAD4 sa dovtedy nedarilo v mtDNA nájsť a sekvencia jeho mRNA sa príliš líšila od všetkých ostatných druhov v databáze. Matúš si všimol, že táto mRNA aj niekoľko iných začnú dávať zmysel a kúsky jej predlohy sa dajú nájsť v mtDNA, ak si predstavíme, že okrem editovania pridaním mnohých písmen dochádza v diplonéme aj k editovaniu ich chemickou premenou – a to na viac než stovke miest, nielen kde-tu, ako je bežné v iných organizmoch. V tomto prípade ide o deamináciu (teda odstránenie skupiny -NH2), ktorá mení špecifické C na U a špecifické A na I (inozín, ktorý však sekvenátor číta ako G). K snahe nájsť enzýmy, ktoré dokážu rozoznať jednotlivé kúsky mRNA, vystrihnúť ich a potom správne pospájať do kompletnej mRNA, tak pribudol ďalší cieľ: identifikovať enzým (RNA deaminázu) presne rozoznávajúci a deaminujúci písmená, ktoré treba opraviť, aby prekladom RNA vznikol správny proteín. Enzýmy s takýmito schopnosťami by sa dali využiť vo výskume aj v biotechnológiách. Napríklad pri výrobe mRNA vakcín sa modifikujú niektoré bázy, čo zvyšuje stabilitu RNA v ľudskom tele. A presné spájanie kúskov RNA by bolo výhodou napríklad pri štúdiu veľkého množstva RNA (napr. vírusov) v procese vytvárania tzv. knižníc RNA.
Úskalia výskumu
Ide však o beh na dlhú trať. Napríklad keď sa vedcom podarilo vytipovať, ktorý gén kóduje rastlinnú RNA deaminázu, trvalo im vyše 20 rokov, než dokázali, že jeho proteínový produkt naozaj plní túto úlohu. Výskumné metódy síce pribúdajú a vylepšujú sa tie existujúce, nikdy však nemožno vopred vedieť, či a ako budú fungovať v konkrétnom prípade.
Ďalším limitujúcim faktorom sú financie. Tie sa na základný výskum získavajú ťažko aj v Kanade, hoci administratíva grantových žiadostí je jednoduchšia než na Slovensku. Aj preto je Matúš už od roku 2017 jediným zamestnancom laboratória a s projektmi občas pomáhajú študenti na niekoľkomesačných stážach. Vedúci profesori, obaja viac ako 70-roční, od pandémie pracujú z domu, píšu najmä žiadosti o granty, podieľajú sa na analýzach dát a písaní článkov, konzultujú i učia online.
Napriek tomu sa už Matúšovi podarilo identifikovať gény pravdepodobne kódujúce RNA deaminázu aj RNA ligázu, ktorá je zrejme zodpovedná za spájanie kúskov mRNA do finálnej mRNA. Rokmi optimalizoval aj metódy ich izolácie z buniek v dostatočnom množstve a kvalite, v súčasnosti sa snaží získať dôkazy ich predpokladaných funkcií.
Rozvetvovanie pôvodného projektu
A ako to neraz býva, pôvodný projekt sa tiež značne rozvetvil – rôzne zistenia otvorili nové smery výskumu, na ktorých Matúš spolupracuje s laboratóriami vo viacerých krajinách. Napríklad vďaka objaveniu a zohľadneniu deaminácie mohol nielen prečítať mnohé dovtedy nepochopené časti mtDNA a nájsť v nich ďalšie gény, ktorých má D. papillatum v mitochondriách spolu 18, ale dozvedel sa z nich aj nové zaujímavosti. Patrí medzi ne aj extrémne krátky gén NAD11 kódujúci podjednotku komplexu I dýchacieho reťazca. Veľká dutina, ktorá v dôsledku krátkosti proteínu Nad11 v tomto komplexe vzniká (ako neskôr ukázali snímky z kryoelektrónového mikroskopu), prekvapujúco nebráni jeho funkcii. Okrem dýchacieho reťazca D. papillatum sa Matúš zaoberal napríklad aj zložením jej mitochondriálneho ribozómu, čiže komplexu proteínov a RNA zodpovedného za preklad informácie z mRNA do proteínov.
Čo ďalej?
V Montreale by Matúš rád ostal, pokým to dovolia financie. Keďže získať miesto priamo na fakulte je nateraz mimoriadne náročné, pracuje naďalej za plat z grantov vedúcej profesorky, ako je na kanadských univerzitách zvykom. Kam sa Matúš vyberie v budúcnosti, je zatiaľ otázne. Ponuka prišla aj z domovskej bratislavskej katedry, ale od návratu na Slovensko Matúša zatiaľ odrádza slabé financovanie vedy a zložitosť jej administratívy.
Viac takýchto článkov a exkluzívneho obsahu môžete získať vďaka predplatnému.
Máte predplatné?
Prihlásiť saFoto archív Matúša Valacha
